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c57小鼠肝组织微粒体蛋白质组表达谱的研究.pdf
微粒体是指细胞匀浆通过差速离心和蔗糖密度梯度离心,去除核组分和线粒体组分后,获得的由破碎的内质网自我融合形成的近球形的膜囊泡状结构。大部分膜囊来自于内质网,也包括其他膜性细胞器的成分,如高尔基体、过氧化物酶体、内涵体、线粒体外膜、内吞小体,以及肝实质细胞、Kupffer 细胞和内皮细胞的质膜。简而言之,微粒体代表的是主要来自于内质网的细胞内膜系统。内质网在细胞内起着重要作用,除了参与蛋白质的合成分泌和修饰加工外,还包括了一大部分参与糖代谢、脂代谢及生物转化的蛋白。因此,微粒体的蛋白质组学研究有助于阐明蛋白质一蛋白质和磷脂一蛋白质之间的相互作用,蛋白质的生物学功能以及结合于膜上的酶的功能特性等。 本研究应用差速离心和蔗糖密度梯度离心从c57小鼠(BL-6)肝组织匀浆中抽提得到高纯度的微粒体。行Western-b10t实验以检验其纯度及污染物的含量。直接应用双向凝胶电泳技术(two-dimensional gel electrophoresis,2-DE)分离纯化后的肝微粒体:同时考虑到构成微粒体的绝大部分为膜组分,而2一DE在膜蛋白的分离方面有较大的困难,因此我们先用Na<,2>CO<,3>抽提出微粒体中的膜蛋白,再用一维SDS—PAGE技术分离膜蛋白。两种方法所分离的蛋白均由ESIQ-TOF予以鉴定。并利用生物信息学资源对所鉴定蛋白质的功能和亚细胞定位等进行分析。 本研究初步建立了c57小鼠肝微粒体蛋白质表达谱。直接对微粒体进行分离的2D参考胶上平均展示点数为1028±83个。选取204个分辨较好的蛋白质点进行鉴定,鉴定出蛋白质185个,其中52个蛋白通过Swiss-prot数据库检索被确定为内质网固有蛋白。内质网标志性蛋白如GRP94、GRP99、及UDP-葡糖醛酰转移酶1-7前体均得到准确鉴定。Na<,2>CO<,3>处理后的微粒体膜组分经SDS PAGE分离后,ESIQ-TOF鉴定出99个蛋白,其中59个为膜蛋白。鉴定出的蛋白中有28个定位于内质网上。内质网标志性膜蛋白:细胞色素P-450和b5,钙网蛋白,以及NADPH-cytochrome c redtlctase等均被鉴定。将两种方法鉴定的蛋白质相互比较、整合,以全面及详尽地揭示c57小鼠肝微粒体的蛋白质组分。我们对鉴定的261个蛋白根据他们的亚细胞定位及生物学功能进行了分类,初步建立了c57小鼠肝微粒体表达谱。
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